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          從培養(yǎng)的細胞中純化總RNA的方法
          
                
          
                  發(fā)布時間： 2021-11-24　　點擊次數(shù)： 1460次  
                
          
                
          
                 
          材料與儀器
          細胞
          RNA 提取緩沖液 變性液 水飽和酚
          培養(yǎng)皿 Falcon 2063 管
          步驟
          1. 取 1 個細胞已長滿的 100 ml 培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)液，加 2 ml RNA 提取緩沖液，用橡膠刮棒刮下細胞。

          RNA 提取緩沖液：

          變性液，20 ml

          β-巰基乙醇，0.144 ml

          2 mol/L 乙酸鈉，pH 4，2 ml

          水飽和酚，22 ml    

          可避光保存在 4℃ 2~3 個月。

          變性液：

          4 mol/L 硫氰酸胍：250 g 硫氰酸胍

          25 mmol/L 檸檬酸鈉：17.6 ml 0.75 mol/L 檸檬酸鈉，pH 7

          0.5% 十二烷基肌氨酸鈉（Sarkoayl）：26.4 ml 10% 十二烷基肌氨酸鈉，293 ml H2O

          混合各組分，在 65℃ 攪拌溶解?？梢栽谑覝乇４?3 個月。

          水飽和酚：

          用在水浴中加熱到 65℃ 的滅菌水來溶解酚。從水浴取出后使冷卻到 4℃。加足量水以維持水相（上相）。可在 4℃ 避光保存 2~3 個月。

          2. 細胞裂解物轉(zhuǎn)移到一個 Falcon 2063 管中，加 200 μl 氯仿，混合均勻。

          3. 細胞冰浴 15 分鐘。

          4. 細胞裂解物在 4℃ 以 5000 g 離心 30 分鐘。

          5. 轉(zhuǎn)移水（上）相，注意不要攪動交界面，水相放到一個干凈的 Falcon 2063 管中并加入 1 ml 異丙醇（僅用于 RNA 工作的溶液）。

          6. 管子在  -20℃ 放至少 1 小時或過夜。

          7. 用固定角度的轉(zhuǎn)頭在 4℃ 以 8000 g 離心 30 分鐘沉淀 RNA，小心去掉上清。

          8. 加 1 ml 70% 乙醇洗白色沉淀物并在以 8000 g 離心 15 分鐘。洗 3 次，不要振搖。

          9. 最后一次 70% 乙醇洗滌后，去掉乙醇并稍稍離心管子收集殘液。吸掉剩下的乙醇。

          10. 短時間干燥沉淀?？諝飧稍锛s 30 分鐘或在真空干燥器中 2~3 分鐘。

          11. 用 50~100 μl DEPC 處理過的水重懸 RNA，測量 1:100 稀釋的樣品的光密度（OD260）來計算濃度。

          濃度（μg/ml）=（稀釋度）[（40 μg/ml·OD260）]（樣品的 OD260）

          12. 重懸的 RNA 貯存在 -70℃。

          
                
          
                
            
          
        
          
     
          
     
          
   
          
 
          
 
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