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          技術文章ARTICLE
          
            
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          細胞勻漿的操作
          
                
          
                  發(fā)布時間： 2021-11-24　　點擊次數(shù)： 4080次  
                
          
                
          
                 
          材料與儀器
          細胞
          緩沖鹽溶液 二異丙基氟瞬酸 勻漿緩沖液
          相差顯微鏡
          步驟
          1. 準備下面的貯液和材料。

          等滲的緩沖鹽溶液（例如 PBS，150 mmol/L NaCl；10 mmol/L NaPO4，pH 7.2)

          二異丙基氟瞬酸（DIFP）

          1 mol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

          0.5 mmol/L K+EGTA，pH 7.0

          0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0

          0.1 mol/L DTT

          NaN3

          蛋白酶抑制劑

          PMSF

          抑胃酶肽 A

          亮抑酶肽

          刀豆胰蛋白酶抑制劑

          勻漿緩沖液：

          0.34 mol/L 蔗糖

          20 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

          5 mmoI/L K+EGTA，pH 7.0

          5 mmol/L K+ATP，pH 7.0

          5 mmol/L DTT ( 干粉或用貯存液）

          50 μmol/L PMSF

          3 mmol/L NaN3

          22 μmol/L 抑胃酶肽 A

          1.2 μmol/L 亮抑酶酞

          10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制劑

          PMSF 可以用 pAPMSF 代替，它更穩(wěn)定，但更貴。

          2. 洗細胞：輕輕地沉降細胞（例如 3000 g 離心 5 分鐘），去掉培養(yǎng)基，通過振搖打碎沉淀物，然后重懸于至少 10 倍體積冰冷的等滲緩沖鹽水中。再次在新鮮的等滲緩沖鹽水中沉降和重懸，總共 3 次。對于不同的細胞類型，離心力和時間應該進行優(yōu)化。

          3. 最終的冰冷的細胞懸液中補加 DIFP，使終濃度為 5.7 mmol/L（每毫升細胞懸液中加 1 μl）。冰浴 5 分鐘。

          4. 上述的步驟 2 沉降細胞，然后重懸于 4~6 倍勻漿緩沖液中。

          5. 細胞勻漿要造成最大破壞，但要盡量減少氧化。

          6. 用相差顯微鏡檢測細胞的裂解，證實超過 99% 都已經(jīng)裂解了。

          
                
          
                
            
          
        
          
     
          
     
          
   
          
 
          
 
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